細(xì)胞是組成自然界生命的基本單位，同時(shí)也是重要的生物資源。低溫制冷技術(shù)的迅速發(fā)展，能夠做到控制細(xì)胞的“生死”，充分利用珍貴的細(xì)胞資源。
凍存是長(zhǎng)期保存細(xì)胞的重要方法，利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于液氮中保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，細(xì)胞進(jìn)入一種假死狀態(tài)。
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01
細(xì)胞凍存
1. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞移至離心管中。
對(duì)數(shù)期細(xì)胞是細(xì)胞增殖過(guò)程中活力旺盛的時(shí)期，也是凍存細(xì)胞的合理時(shí)期，對(duì)于貼壁細(xì)胞先用胰蛋白酶分離成單個(gè)細(xì)胞再收集到離心管中，懸浮細(xì)胞可直接移至離心管中。
2. 離心去除胰蛋白酶及培養(yǎng)液，加入凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻。
3.細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的終密度。
4. 將細(xì)胞分裝入凍存管中，在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。
5.凍存管放入程序降溫盒，放入超低溫冰箱中過(guò)夜。
對(duì)于大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，降溫速率通常每分鐘下降1至3℃。的方法是使用程序降溫系統(tǒng)。其次可以使用程序降溫盒，雖然這種方法適用于許多細(xì)胞系，但不能提供均勻可控的冷卻，不建議用于珍貴細(xì)胞。
6.從超低溫冰箱中取出程序降溫盒，取出凍存管迅速浸入液氮中。
細(xì)胞儲(chǔ)存應(yīng)始終保持溫度低于-130°C。細(xì)胞可以在更高的溫度下保存，但生存力通常會(huì)隨著時(shí)間的推移而降低。理想的儲(chǔ)存容器是液氮罐，出于安全原因，優(yōu)選選擇氣相液氮儲(chǔ)存。
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無(wú)論使用哪種凍存方法，關(guān)鍵的是快速高效地將其傳輸?shù)酱鎯?chǔ)位置。如果不能立即完成，可以將小瓶置于干冰上一段時(shí)間。這樣可以避免在轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生溫度升高而損害細(xì)胞，在這個(gè)轉(zhuǎn)移過(guò)程中溫度升高是解凍后影響細(xì)胞活力的主要原因。
細(xì)胞凍存關(guān)鍵因素：
1.適當(dāng)?shù)奶幚砑皽睾褪占?xì)胞
2.使用合適的冷凍保護(hù)劑
3.細(xì)胞凍存的速率
4.合適的儲(chǔ)存溫度
02
細(xì)胞復(fù)蘇
1.從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。
2.取出凍存管，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并加培養(yǎng)液混勻。
3.離心棄去上清液，加入血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
4.計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度，放入CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
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細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本過(guò)程是慢凍快融，這樣可以很大限度的保存細(xì)胞活力。細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入甘油或二甲基亞砜之類的保護(hù)劑可使溶液冰點(diǎn)降低，配合使用4℃冰箱和-20℃低溫冰箱梯度降溫，在緩慢凍結(jié)條件下，細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞則采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
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